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产品FAQ

细胞培养常见问题解答

Q:培养基 pH 值异常

A:

? 二氧化碳分压设置错误:根据培养基中碳酸氢钠的浓度而增加或降低培养箱中二氧化碳分压。

? 培养箱无二氧化碳:定期观察二氧化碳压力表,及时更?#27426;?#27687;化碳?#21046;俊?/span>

? 细胞培养瓶盖拧得过紧?#33322;?#30422;子旋松 1/4 圈,或换成透气盖培养瓶。

? 细菌、真菌污染 丢弃细胞和培养基。

? 培养基中的平衡盐不匹配:二氧化?#35745;?#34913;环?#25345;?#20351;用以 Earle's 平衡盐为基础的培养基,大气条件下使用以Hank's 平衡盐为基础的培养基。

? 碳酸氢盐缓冲系统缓冲能力不足:加入 HEPES 缓冲液,使其终浓度为 10-25 mM。


Q:细胞生长缓慢

A:

? 培养基或血清改变:比较不同培养基中葡萄糖、氨基酸等成分有无差异;增加细胞接?#32622;?#24230;;更换新鲜培养基。

? 必需生长促进成分 ( 如 L- 谷氨酰胺或生长因子 ) 缺乏、耗尽或?#21040;?#20351;用新鲜培养基或向现有培养基中添加必需成分。

? 细胞初始接?#32622;?#24230;过低:增大细胞接?#32622;芏取?/span>

? 支原体污染:检测培养物有无支原体污染,如果被污染,则弃之,或用支原体清除试剂进行清除。

? 细胞代次过高:取用新的细胞。

? 轻度细菌或真菌污染:在添加抗生素的培养基中培养细胞,如果培养物被污染,则弃之。

试剂储存不当血清应置于-5℃至 -20℃下储存 ;培养基应置于 2-8℃下避光储存;完全培养基应置于2-8℃下避光储存,并限在2周内使用。


Q:细胞死亡

A:

? 胰酶消化过度?#26680;?#30701;胰酶消化时间或降低消化用胰酶的工作浓?#21462;?/span>

? 细胞状态差:取用新的细胞。

? 支原体污染:检测培养物有无支原体污染,如果被污染,则弃之,或用支原体清除试剂进行清除。

? 培养基中无附着因子:如采用无血清培养方法,应确保其含有附着因子,或使用包被过的培养器皿。

? 培养箱中无二氧化碳:定期观察二氧化碳压力表,及时更?#27426;?#27687;化碳?#21046;俊?/span>

? 培养箱温度有波动:监测培养箱内温?#21462;?/span>

? 转染试剂毒性过强,细胞代次过高,质粒纯度差使用低毒性的转染试剂或在转染后及时换液;使用低代次细胞转染 ;使用高品?#23454;?#36136;粒转染。

? 细胞解冻或冻存过程中损伤大:取用新的细胞。

? 培养基的渗透压不正确:检查完全培养基的渗透压。大多数哺乳动物细胞可耐受的渗透压为 260-350 mOsmol/kg,昆虫细胞可耐受的渗透压为 340-380 mOsmol/kg。

? 培养基中有毒代谢产物蓄积过多:更换新鲜培养基。


Protein Marker使用常见问题解答

Q:条带模糊的原因?

A:

? 电?#26500;?#39640;或电泳时间过长,产热过多导致电泳缓冲液温度升高。建议参照Trans产品使用?#24471;?#20070;。

? 电泳缓冲液陈旧,建议使用新?#23454;?#30005;泳缓冲液,为了获得理想的结果建议在使用前预冷缓冲液。

? 分离胶的浓度偏低,建议使用合?#23454;慕号ǘ取?/span>

? 凝胶放置时间过长,建议使用新配制的凝胶电?#23613;?/span>


Q: 为什?#20174;?#26102;候带型不整齐?

A:

? 建议点样时将蛋白Marker放在泳道中间。如在凝胶?#35762;?#27891;道,由于边缘效应、离子强度不均等原因,均会导致带型变宽或弯曲。

? 凝?#21495;?#21046;不匀,凝胶内存有气泡,或点样孔中有细碎的残胶。


Q:电泳时蛋白Marker分离不开?

A:大多为?#21495;?#24230;不合适,要在推荐的凝?#21495;?#24230;范围内使用。此外,比较陈旧的凝胶?#31361;?#20914;液?#19981;?#36896;成电泳效果不好。


Q:预染Marker电泳后清晰,但是转膜后颜色很?#24120;?/span>

A:

? 转膜时一定要将胶和膜压紧,否则条带会在转膜过程中丢失或变浅。

? 转膜条件不适合,建议200 mA、2小时,或100 mA过夜转膜。


Q:转膜时?#29366;?#30340;浓度是多少,会对转膜造成什?#20174;?#21709;?

A:?#29366;?#30340;浓度一般推荐为15%,?#29366;?#27987;度太高易造成蛋白穿膜,转移到滤纸上。


Q:发光?#21495;?#21046;需要避光吗?

A:不需要避光,但是要现配现用,配制后马上进入暗室进行下面的操作。


Q:发光液的有效曝光时间多长?

A:发光液在2小时以内均可以曝光,但是前30分钟曝光能力较强,随着时间的推?#29942;墑实?#24310;长曝光时间来调节曝光强?#21462;?/span>


Q:曝光后X光片背景很黑是什么原因?

A:背景很黑可能是曝光时间太长或者显影时间过长造成的。


Q:Western Marker 曝光后杂带很多是什么原因?

A:Marker上样?#25239;?#22810;或曝光时间过长,可?#23454;?#20943;少上样量或曝光时间。此外,二抗的浓度过高或特异性和纯度不高,?#19981;?#36896;成杂带较多的结果。


His标签蛋白纯化常见问题解答

Q:层析柱堵塞?

A:待纯化蛋白样品中存在固体杂质,多见于菌体裂解液直接上样。建议对样品微滤 (0.45μm) 处理。


Q:目的蛋白不与介?#24335;?#21512;?

A:

? 目的蛋白没有 His 标签,其原因可能是载体构建有误、表达提前终止 (C端融合表达His 标签)、二级翻译起始 (N端融合表达His标签)等等。建议测序检查,或尝试更换表达载体。

? His标签折叠在蛋白质内部没有暴露。该情况多见于包涵体蛋白在变性条件下的纯化。建

议充分变性蛋白,可以尝试使用更强的变性剂 (如用6 M盐酸胍代替 8 M尿素)、加入助溶剂 (SDS) 或还原剂 (DTT、β-巯基乙醇) 等方法。

? 缓冲液存在问题。使用 Ni-NTA 或 Ni-IDA 介质纯化 His 标签蛋白时,平衡缓冲液与样品缓冲液中的某些组分可能会干扰目的蛋白的结合。

部分组分建议浓度如下 :

 EDTA: ≤0.1 mM (建议不要使用)

 DTT: ≤1 mM (不推荐使用)

 β-巯基乙醇: ≤20 mM (慎用)

 咪唑: ≤20 mM (因蛋白而异)


Q?#21512;?#33073;液中杂蛋白多?

A:

? 洗脱条件不合适。建议使用咪唑浓度梯度或 pH 值梯度洗脱。不同蛋白质最佳洗脱条件不同,需要摸索优化。

? 杂蛋白与介质存在非特异性结合。建议在平衡缓冲液与样品缓冲液中加入一定浓度的咪唑 (推荐浓度 : ≤20 mM,因蛋白而异),抑?#21697;?#29305;异性结合。

? 杂蛋白与目的蛋白存在非特异性结合。建议在平衡缓冲液与样品缓冲液中加入非离子型去垢剂 (Triton X-100: ≤1%)、?#35270;?(≤10%)、NaCl (≥300 mM)、还原剂 (β- 巯基乙醇 : ≤20 mM) 等组分。

? 目的蛋白?#21040;狻?#24314;议在低温下纯化目的蛋白,并在平衡缓冲液与样品缓冲液中加入蛋白酶抑制剂 (如 PMSF)。

? 存在表达提前终止 (C 端融合表达 His 标签) 或二级翻译起始 (N端融合表达 His 标签)。建议更换表达载体。


Q:目的蛋白没有洗脱?

A:

? 目的蛋白量太少,无法检出。建议更换灵敏度更高的检测方法,如用银染法或 Western Blot 替代考马斯亮?#24230;旧?#25110;优化上游表达条件,获?#37238;?#22810;的目的蛋白。

? 目的蛋白没有结合介质。建议检测以下全部样品以确认蛋白:上样前、流出、洗涤、洗脱。

? 目的蛋白结合牢固。建议增加洗脱强度,如采用更高浓度的咪唑或更低的 pH 值。


原核蛋白表达常见问题解答

Q:蛋白不表达或表达量很低?

A:

1、选择正确的表达载体与表达菌株

? T7启动子的载体(如pET系列载体)应选用BL21(DE3),BL21(DE3) pLysS,Transetta(DE3) 等菌株。非T7启动子的表达载体 (如Tac启动子的pGEX、pMAL系列表达载体) 应选用BL21表达菌株。

? 对细胞有毒性的蛋白,建议选用背景表达低、严谨调控诱导的菌株,如BL21(DE3) pLysS菌株。

? 对于带有稀有密码子的蛋白或来?#20174;?#30495;核基因的蛋白,建议选用Transetta(DE3) 等菌株。

2、尝试不同的表达载体与菌株

   不同的蛋白,对不同载体与菌株的偏好不同,如果某一蛋白无法通过优化诱导表达条件得到明显改善,可以更换其它菌株或表达载体。

3、表达条件的优化

? 选择不同的培养基。对于某些蛋白,在培养基中加入适量的葡萄糖(0.1%-0.5%),可以明显提高表达量。

? ?#32454;?#30340;温?#21462;⒔细?#30340;诱导物浓?#21462;?#36739;长的表达时间,一般可以加快表达的速度,促进目的蛋白的积累,从而提高表达量。但可能会降低可溶蛋白的表达量,形成包涵体。

? 细胞的生长状态对蛋白表达有很大的影响,可以通过测量菌液的OD600?#23548;?#27979;生长状态。对于大部分蛋白,应在菌株的对数生长期(OD600=0.5) 进行诱导。


Q:目的蛋白不可溶,形成包涵体?

A:

首先确认目的蛋白是否有表达。

? 裂解菌体并离心后,通过对全菌、上清、沉淀的检测,确认目的蛋白是否表达,是否形成了包涵体。

? 包涵体的形成与蛋白自身结构、表达系统、诱导表达条件等因素有着密切关系。在无法改变蛋白自身结构的情况下,可以尝试不同的表达载体与菌株,增强其溶解能力,优化出适合特定蛋白的表达系统。

? 目前认为包涵体的形成是由于蛋白在细胞内积累速度过快,没有正确折叠而聚集沉淀。可以通过优化诱导表达条件,如降低诱导温?#21462;?#38477;低诱导物浓?#21462;?#32553;短表达时间、降低诱?#38469;?#33740;液的OD值等,以减缓蛋白的积累。


Q:目的蛋白大小不正确?

A:

? 蛋白的结构对判断分子量大小有一定影响。可以通过加热变性蛋白,从而准确判断蛋白分子量大小。

? 确认蛋白表达是否完整,蛋白是否提前终止表达。

? 若形成二聚体甚至多聚体,可以通过加热变性蛋白、打开二硫键 (加入DTT、β-ME等还原剂) 等手段,破坏次级结构,准确判断分子量大小。


RNA纯化常见问题解答

Q:提取过程中 RNA ?#21040;?/span>

A:

? 材料中的 RNA 发生?#21040;猓?#23613;量选择新?#23454;?#26448;料,材料采集后应迅速用液氮处理。材料

保存在液氮中或 -70℃条件下,材料均不宜长期保存,且避免反复冻融。幼嫩新?#23454;?#26448;料 RNA 含量高且完整,衰老或病害等受损的材料中 RNA ?#21040;?#27604;较?#29616;亍?/span>

? 操作环境的 RNase 污染:RNA 提取尽量选择洁净的环?#24120;?#30001;于?#21248;?#26465;件下空气中含有较多的 RNase,建议对提取环境进行 RNase 的清除处理。

? 提取用具带来的 RNase污染:提取用所有的玻璃器皿可通过高温灭活 (160℃烘烤 4-5 小时)去除 RNase。RNA 材料所接触的所有塑料制品 (如枪头、电泳槽、移液器等)都需要通过 DEPC 或 NaOH 处理?#32454;?#21435;除 RNase 后才可使用。

? 操作中带入的 RNase 污染:人的皮肤、汗液和呼出的气体中含有大量的 RNase。操作人

员可通过经常更换一次性手套,佩戴口罩等措施减少此类污染。


Q:RNA 提取量低

A:

? 材料 RNA 含量?#31995;停?#23545;于 RNA 含量?#31995;?#30340;纤维组织 (肌肉组织或纤维素?#32454;?#30340;植

物组织) 可?#23454;?#25552;高起始材料的用量。

? 材料中蛋白和脂肪含量?#32454;擼?#34507;白和脂肪含量?#32454;?#30340;材料可用?#30830;?#23545;上清再次抽提。

? RNA 沉淀条件不合适:使用异丙醇沉淀 RNA 时,加入的异丙醇与提取液的比例为严

格的 1:1,否则会明显影响 RNA 沉淀的效率和 RNA 的纯?#21462;?#29305;殊材料 (如含有多糖、多酚等) 可通过添加适量的柠檬酸钠来改善沉淀效果。


Q:RNA 中有基因组 DNA 污染

A:

? 材料中核酸含量高:脾脏、胸腺等组织中的核酸含量?#32454;擼?#21487;进行多次酚 / ?#30830;?#25277;

提以去除多余的 DNA。也可以在提取后加入 DNase I 处理,?#21040;?DNA。

? 材料过量:增加试剂用量。

? RNA 沉淀条件不合适:使用异丙醇沉淀 RNA 时,加入的异丙醇与提取液的比例偏高,

溶液的 pH 值偏小,都容易使 DNA 形成沉淀。


Q:提取后的 RNA 样品?#21040;?/span>

A:

? RNA 样品反复冻融:反复冻融会使 RNA 片段断裂,影响 RNA 的完整性。

? RNA 样品保存条件不合适:根据保存时间和材料的不同,RNA 应保存在不同的溶液中。

如从胰脏、肝脏等 RNase 含量?#32454;?#30340;材料中提取的样品需要储存在甲醛或甲酰?#20998;?#20197;保存高质量的 RNA,而在脾脏中提取的 RNA 可在水中长期稳定保存。


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